La Basílica ocupa la parte central de todo el conjunto arquitectónico del Monasterio, y en torno a ella se articulan las demás dependencias.
El templo fue realizado por Juan de Herrera. Es una obra maestra de la arquitectura española del Renacimiento. La Basílica, con planta de cruz griega, forma un cuadrado de 50 metros de lado y está dividida por tres naves cubiertas con bóveda de cañón, separadas por cuatro enormes pilares dóricos de 8 metros de lado cada uno y decorados con dos filas de pilastras dóricas; sobre ellos se levanta el granítico cimborrio circular de 17 metros de diámetro y 92 metros de altura, inspirado en la cúpula del Vaticano, con tambor sobre pechinas y ocho grandes ventanales. Un gran pasadizo recorre el perímetro interior, a considerable altura, desde donde se puede dominar la extensión y magnificencia de la nave central, la maravilla del altar mayor y los detalles de las pinturas de las bóvedas.
El Concilio de Trento exige que las iglesias sean de cruz latina; para resolver el problema se añade a la cabecera de la nave central la capilla mayor con su presbiterio y retablo, y en la entrada, el coro bajo con su bóveda plana y sobre ella el coro alto, de manera que la Basílica llega a tener forma de cruz latina. La Basílica está realizada en sillería de granito, el pavimento es de mármol blanco y gris.
Además del altar mayor, cuenta la Basílica con otros cuarenta altares menores para la celebración eucarística. Cada uno está formado por la mesa de altar y un cuadro que hace de retablo. En las distintas pinturas pueden contemplarse una serie de santos y santas: apóstoles, doctores, mártires, vírgenes…; de todos ellos, treinta y seis se presentan con parejas de santos. Las pinturas se encomendaron a artistas españoles: Juan Fernández Navarrete (El Mudo), Diego de Urbina, Alonso Sánchez Coello y Luis de Carvajal. El motivo de tanto altar se debe a la previsión de Felipe II, quien además de la construcción del Monasterio, estableció también que se celebraran gran cantidad de misas rezadas y cantadas por su eterno descanso y el de toda su familia.
La lámpara y los púlpitos en mármol y bronce dorado pertenecen al reinado de Fernando VI. El púlpito del evangelio presenta los medallones de los cuatro evangelistas, el escudo real y remata con una matrona, símbolo de la religión. Los medallones del lado de la epístola son de los cuatro doctores de la Iglesia, el escudo del rey y la matrona que representa la fe.