El tabernáculo, donde se guardan las sagradas formas, es una obra única en su género. Está situado en el centro del primer cuerpo del retablo mayor y es el punto de mayor expresividad y simbolismo, y hacia donde confluyen todas las miradas. Está iluminado a contraluz desde el Patio de Mascarones, característica que influirá en los transparentes españoles del Barroco.
El tabernáculo es una joya insuperable, diseñada por Juan de Herrera y realizada por el orfebre italiano Jacomo da Trezzo; siete años tardó en su realización. Tiene la forma de templete circular de orden corintio, realizado en mármoles y jaspes de diferentes colores enmarcados en bronce dorado al fuego y rematado por una cúpula, tiene un rico zócalo de jaspes como base y sobre él se levantan ocho columnas del mismo material. Los cuatro evangelistas colocados en los intercolumnios del templete sirven como decoración escultórica. Sobre la cornisa están colocados ocho apóstoles, y la figura de el Salvador remata el cupulín. Estas pequeñas esculturas también son obra de Leoni. Las dos puertas que dan acceso a la parte posterior del tabernáculo son de caoba forradas de jaspes de colores.
Cuatro escenas del Antiguo Testamento, pintadas por Tibaldi, decoran el pequeño espacio que hay detrás del Tabernáculo, están pintadas con una técnica que hoy bien pudiéramos llamar ”técnica puntillista”. Son escenas simbólicas, alusivas a la eucaristía y representan: la recogida del Maná, el abrazo de Abrahán y Melquisedec, el encuentro de Elías con el ángel y el rito del cordero pascual. En la bóveda, el mismo pintor plasma el arco iris flanqueado por cabezas de querubines.