En la cabecera de la capilla mayor encontramos el retablo mayor y el tabernáculo. El retablo es un conjunto arquitectónico, escultórico y pictórico excepcional, de unas características muy clásicas y sobrias. Fue diseñado por Juan de Herrera; en él trata de exaltar los dogmas católicos siguiendo los principios de Trento, dogmas que eran negados por el protestantismo. Está realizado en mármoles y jaspes de colores, bronce dorado al fuego y pinturas al óleo sobre lienzo. La arquitectura del retablo se ajusta al modelo romano con columnas de los distintos órdenes clásicos superpuestos en distintos niveles; distribuyendo calles para las ocho pinturas y las quince hornacinas para las esculturas de santos, la Virgen y el Crucificado.
Mide 14 m. de ancho por 26 m. de alto El primer cuerpo, formado por seis columnas dóricas y estriadas, sostiene un arquitrabe. En el centro del retablo se sitúa el tabernáculo para custodia de la eucaristía. La presencia de Cristo en la tierra está simbolizada por dos óleos de Pellegrino Tibaldi: “La adoración de los pastores” y “La adoración de los Reyes Magos”. Las esculturas representan a los cuatros Padres de la Iglesia occidental: San Gregorio Magno, San Ambrosio, San Agustín y San Jerónimo. Son de Pompeyo Leoni.
El segundo cuerpo los forman seis columnas jónicas estriadas de mármol rojizo, que sostiene un arquitrabe. Las pinturas son símbolos de la pasión de Cristo y el culto a los santos. El cuadro central representa “El martirio de San Lorenzo”, de Peregrino Tibaldi, y a los lados “La flagelación” y “Jesús con la cruz a cuestas”, de Federico Zuccaro. Las esculturas de los cuatro evangelistas acompañados por sus símbolos son de Pompeyo Leoni.
El tercer nivel con columnas de orden corintio sostiene también un arquitrabe y está concebido como símbolo de la gloria. “La Asunción de la Virgen”, en el centro, y a los lados “La resurrección” y “Venida del Espíritu Santo sobre los apóstoles”, de Federico Zuccaro. Las dos esculturas laterales son de Pompeyo Leoni y representan a Santiago, y san Andrés, apóstoles.
El último cuerpo remata en un ático de orden compuesto. El conjunto escultórico representa el Calvario, Cristo crucificado en el centro, la Virgen y san Juan. Las esculturas laterales representan a san Pedro y san Pablo, pilares de la Iglesia. La última imagen lleva la firma del autor: Pompeius Leoni (fecit) 1588.
Para evitar el efecto óptico contrario, el tamaño de las esculturas va creciendo de abajo hacia arriba.