El coro es la pieza fundamental en la vida de los monjes. Es desde donde mejor se percibe la grandeza de la Basílica y de la capilla mayor. Como era tradicional en los monasterios españoles, está colocado en alto, sobre el bajo coro, en un recinto de 14 metros de ancho por 26 de largo. En el centro del coro, está el facistol (atril giratorio donde se colocaban los cantorales para el canto), diseñado por Juan de Herrera. Tiene más de cuatro metros de altura y pesa unas 30 toneladas. Su forma es de pirámide truncada, hecho de madera de ácana y bronce dorado, remata en un bello templete en forma de cruz griega y en el interior hay una pequeña estatua de la Virgen, atribuida a la Roldana. El templete está rematado por un crucifijo.
La sillería, dividida en dos tramos, está compuesta de 124 asientos, muy sencillos, idénticos los de ambos cuerpos. Sobre los tramos de los del piso superior corre una cornisa y un friso, apoyados sobre columnas corintias acanaladas. El diseño es de Juan de Herrera y la ejecución del ebanista italiano Giuseppe Flecha. En el tramo superior destaca el asiento prioral por su riqueza arquitectónica, por el lienzo del Nazareno de Sebastián del Piombo, de fines del siglo XVI y por una pequeña imagen de san Lorenzo. El coro está iluminado por amplios ventanales que dan al Patio de Reyes.
Como dato curioso, en el ángulo izquierdo está el asiento -un poco más ancho que los demás- que ocupaba Felipe II cuando asistía a los oficios religiosos. Una pequeña puerta, hoy tapiada, le permitía el acceso discreto a los rezos.
Las paredes laterales están decoradas con pinturas de Lucas Cambiasso (Luchetto) y Rómulo Cincinnati y representan distintos episodios de la vida de san Lorenzo (patrono del Monasterio) y san Jerónimo (padre fundador de los jerónimos, bajo cuyo cuidado estaba el Monasterio); en el frontal, se representan nuevamente a estos dos santos y la Anunciación. Otros espacios se decoran con figuras en forma de matronas que representan la fe, la Iglesia y las cuatro virtudes cardinales: (prudencia, justicia, fortaleza y templanza). Su autor es Luchetto.
Del centro de la bóveda del coro cuelga una magnífica lámpara de cristal de roca, donada por Carlos II al Monasterio.